“Identificarea prin reactia microarray a unor biomarkeri tumorali cu valoare de predictie noninvaziva in cancerul de prostata.”

Proiectul este realizat in cadrul Programului National de Cercetare, Dezvoltare si Inovare PN II - IDEI, program finantat de Autoritatea Nationala pentru Cercetare Stiintifica. (IDEI grant number 397/2007).

Descriere proiect
Durata de desfasurare proiect
Valoarea proiectului
Echipa de cercetare
Gradul de implicare al tinerilor cercetatori
Obiective si activitati si gradul de realizare
Director proiect
Rezultate obtinute
Articole publicate
Perfectionare doctoranzi

Descriere proiect
Cancerul de prostata reprezinta a doua cauza de deces in randul populatiei masculine in randul tarilor industrializate. Analizele de genetica moleculara in cancerul de prostata au aratat ca mecanismele care stau la baza carcinogenezei prostatei sunt complicate si necesita o investigare complexa. Identificarea de noi biomarkeri pentru diagnostic si de tinte noi pentru terapie poate contribui la o mai buna intelegere a proceselor biochimice care caracterizeaza transformarea celulelor normale in celule maligne si reprezinta totodata un progres real asupra tratamentului cancerului de prostata. Nevoile clinice pentru definirea biomarkerilor moleculari la nivel transcriptomic care sa studieze cancerul, au dus la aparitia tehnologiilor de genomica (microarray) si proteomica (two- dimesional gel electrophoresis) care sunt capabile sa furnizeze baze de date informationale complexe necesare cercetarii clinice. Scopul acestui proiect este de a detecta noi molecule in cancerul de prostata (biomarkeri moleculari) a caror valori de expresie au implicatii directe asupra evolutiei si progresiei tumorale, precum si in identificarea de noi biomarkeri cu valoare predictiva noninvaziva la nivel seric si urinar. Obiectivul principal al studiului consta intr-o analiza de genomica complexa utilizand reactia microarray (Whole Human Genome) cu scopul obtinerii unor semnaturi moleculare transcriptomice (Clustere de diferentiere) la nivel tisular (benign vs malign). Obiectivele secundare au ca scop investigarea prin tehnici de finete la nivel seric si urinar (PCR cantitativ si proteomica 2D) a genelor cu valoare statistica (obtinute la nivel tisular prin tehnica microarray). Deasemenea se urmareste corelarea nivelelor de expresie genica tisulara, serica si urinara a principalelor gene implicate in transformarea maligna precum si stabilirea importantei acestora in definirea ca biomarkeri moleculari cu valoare de screening noninvaziv.

Durata de desfasurare proiect: 01.10.2007— 30.09.2010
Valoarea proiectului: 1.000.0000 RON
Valoare finantata: 771272.25
Cod Proiect CNCSIS: 314/2007


Echipa de cercetare:
Dr. Ovidiu Balacescu- Director de Proiect

Conf Dr. Coman Ioan
Sef Lucrari Dr. Neagoe Ioana
Dr. Popescu Sorin
Drd. Ramona Suharoschi
Drd. Nicu Crisan
Drd. Bogdan Feciche

Director proiect:
Dr. Ovidiu Balacescu

Institutul Oncologic “I. Chiricuta” Cluj-Napoca
Departamentul de Patologie Experimentala, Str. Gh. Bilascu nr 34-36, Cluj Napoca
Cod 400015
Tel: 0264-590638, Fax: 0264-590638, Email: obalacescu@yahoo.com

Gradul de implicare al tinerilor cercetatori
Tinerii cercetatori sunt implicati in toate activitatile proiectului de cercetare functie de specializarea fiecaruia:
• Recoltarea probelor biologice
– Dr. Nicolae Crisan (Drd)
– Dr. Bogdan Feciche (Drd)
• Extractia serului din sangele integral
– Dr. Nicolae Crisan (Drd)
– Dr. Bogdan Feciche (Drd)
• Extractia ARN din tesut si sangele integral
– Dr Ramona Suharoschi (Drd)
• Sinteza si evaluarea sondelor microarray
– Dr Ramona Suharoschi (Drd)
• Studiul de PCR array pe sange integral
– Dr Ramona Suharoschi (Drd)
– Dr. Nicolae Crisan (Drd)
• Studiul de microarray pe tesut
– Dr Ramona Suharoschi (Drd)
• Studiul de proteomica prin electroforeza
– Dr Ramona Suharoschi (Drd)
• Redactarea de publicatii stiintifice
– Dr Ramona Suharoschi (Drd)
– Dr. Nicolae Crisan (Drd)
– Dr. Bogdan Feciche (Drd)
• Brevete de cercetare
– Dr. Nicolae Crisan (Drd)

Obiective si activitati si gradul de realizare:

2007 (obiectivele si activitatile au fost realizate in totalitate)
Ob- Infiintarea biobancii de probe biologice: tesut, sange (ARN si ser), urina;
A1- Selectarea pacientilor functie de valorile PSA si DRE
A2- Gruparea pacientilor functie de stadializare (benign vs malign)
A3- Recoltarea de probe biologice (tesut, sange si urina)

2008- (obiectivele si activitatile au fost realizate in totalitate)
Ob -Consolidarea biobancii, procesarea probelor biologice si pregatirea studiului de genomica functionala;
A1-Continuarea recoltarii de probe biologice (tesut, sange, urina)
A2- Extractia de ARN total din tesuturile de prostata; cuantificarea prin tehnici de nanotehnologie a calitatii si cantitatii ARN-urilor extrase
A3 - Sinteza de ADNc de pe matritele de ARN pregatite anterior
A4 - Sinteza sondelor de microarray (ARNcomplemantar) marcate fluorescent cu Cy3.

2009 (obiectivele si activitatile adaptate functie de bugetul diminuat au fost realizate in totalitate)
Ob-realizarea studiului de genomica functionala si validarea rezultatelor obtinute;
A1- Realizarea reactiei microarray, Evaluarea preliminara a datelor microarray, studiu de bioinformatica
A2- Validarea prin reactia de PCR cantitativ a genelor cu valoare statistica la nivel tisular si sangvin

2010 (obiectivele si activitatile adaptate functie de bugetul diminuat au fost realizate in totalitate)
Ob- Realizarea studiului de Proteomica utilizand analiza de electroforeza; Corelarea datelor de genomica functionala cu cele de proteomica
A1- Extractia proteinelor din aceleasi probe biologice recoltate (tesut, ser) din care s-a extras ARN-ul utilizat pentru studiile de genomica functionala
A2 - Corelarea nivelelor de expresie genica (ARN mesager) cu poteinele aferente acestora la nivel seric si tisular
A3- Corelarea nivelelor de proteine serice cu valoare de biomarkeri tumorali cu valorile PSA si DRE

Rezultate obtinute
Biobanca de probe biologice in domeniul prostatei (tesut, ser, urina), respectiv produsii de extractie (ARN la nivel tisular si al sangelui integral).
In biobanca au fos inclusi peste 90 de pacienti diagnosticati cu prostatica cronica, hiperplazie benigna respectiv adenocarcinom de prostata. Au fost deasemena incluse in biobanca sange si ser de la 10 subiecti sanatosi, respectiv fragmente de tesut normal din piesele de prostatectomie de la 7 pacienti.

Probele biologice au fost procesate functie de cerintele studiilor de genomica functionala. Extractia ARN-ului tisular s-a facut pirn metoda clasica cu fenol-izopropanol- etanol urmata de purificarea pe coloane Qiagen (Rneasy mini kit)
(Sigma). Recoltarea sangelui in vederea extractiei de ARN s-a facut direct pe tuburi PaxGene, urmata de extractia ARN-ului cu kitul PaxGene. Tuturor probelor li s-a facut tratament cu DN-aza in vederea eliminarii contaminarii cu ADN. Extractia ARN-ului urinar s-a facut cu ajutorul kitului mini RNA Isolation I KitTM. Controalele de calitate si cantitate pentru toate ARN-urile extrase s-a facut prin nanotehnologie, utilizand aparatele Bioanalizorul 2100 (Agilent) respectiv spectrofotometrul Nanodrop ND-1000. Avantajul nanotehnologiilor este dat atat de utilizarea unei cantitati reduse de material genetic cat si de obtinerea unor rezultate reproductibile si exacte. Au fost sintetizate sonde microarray marcate cu Cy3 utilizand kitul LILAK al companiei Agilent.
Zona de cercetare a biomarkerilor serici cu valoare de predictie noninvaziva s-a indreptat catre mecanismul angiogenezei, unul dintre cele mai importante implicate in dezvoltarea tumorala. Astfel a fost inclus in studiu serul a 40 de pacienti grupati functie de patologia prostatei:(adenocarcinom de prostata (n=17), hiperplazie benigna de prostata (n=11), prostatita cronica (n=6), respectiv un lot control de subiecti sanatosi (n=6). Au fost evaluate 8 molecule angiogenice (PDGF-BB, VEGF, FGF-b, ANG, KGF, TIMP-1, ICAM-1, ANG-2) utilizand tehnica de FAST Quant® array. Rezulatele studiului au aratat diferente statistic semnificative pentru KGF, ANG2, PDGF-BB si TIMP-1 pentru patologia aleasa.

Datele microarray la nivel tisular au pus in evidenta gene implicate in diferite mecanisme moleculare precum: angiogenza, transcriptie, ciclul celular, apotoza, activitate kinazica. Datorita constrangeriler bugetare s-au ales 4 gene pentru validare prin qRT-PCR. Cele 4 gene sunt implicate in modularea angiogenezei (VEGFA, TIMP1, PDGFA, TNF).

La nivelul sangelui integral s-a incercat identificarea de molecule cu valoare de predictie noninvaziva in cancerul de prostata, iar din datele microarray s-a stabilit ca este oportuna evaluarea mecanismului de angiogeneza. Astfel s-a ales o evaluare a unui numar de 84 de gene, implicate in mecanismul angiogenezei. Au fost alese 36 probe pentru analizat, 19 Pca, 11 cu HBP si 5 controale (subiecti sanatosi). Evaluarea mecanismului de angiogeneza s-a facut cu kitul The Human Angiogenesis RT² Profiler™ PCR Array, prin tehnologia Roche (Light Cycler 480). Datele de expresie genica au fost obtinute cu metoda ΔΔCt cu normalizarea nivelelor de expresie genica la un set de 5 gene housekeeping. Intre PCa si HBP nu au fost obtinute diferente statistice semnificative, dat fiind numarul mic de probe de HBP luate in lucru si gruparea acestora in arbori de diferentiere genica diferiti. In schimb intre PCa si control au fost evidentiate 28 de gene (3 supraexprimate iar 25 subexprimate) care au avut un nivel de expresie  ±1.5. Deasemenea aceasta semnatura moleculara din sangele integral a grupat cu o acuratete mare, pacientii cu cancer de prostata de ceilalalti pacienti cu patologia prostatei (hiperplazie benigna a prostatei respectiv prostatita cronica).


Articole publicate:

1. Bălăcescu L, Bălăcescu O, Crişan N, Fetica B, Petruţ B, Bungărdean C, Rus M, Tudoran O, Meurice G, Irimie A, Dragoş N, Berindan-Neagoe I. Identifying molecular features for prostate cancer with Gleason 7 based on microarray gene expression profiles. Rom J Morphol Embryol. 2011;52(4):1195-202.

2. Balacescu O, Neagoe I, Balacescu L, Crisan N, Feciche B, Tudoran O, Coman I, Irimie A. Angiogenesis serum protein quantification for Prostate patholgy (BDI). Curr Urol 2008; 2: 181-187 (ISSN 1661-7649). Karger group.

3. Floares, A. Balacescu, O. Floares, C. Balacescu, L. Popa, T. Vermesan, O. Mining knowledge and data to discover intelligent molecular biomarkers: Prostate cancer i-Biomarkers; 10.1109/SOFA.2010.5565613 2010: pag 113 – 118.


Patent national depus la OSIM: (nr de inregistrareOSIM: A/10030/2010. Metoda non-inaziva de detectare a cancerului de prostata bazata pe analiza expresieo unui set de gene implicate in mecanismul de angiogeneza (Dr. Balacescu Ovidiu, Prof Dr. Neagoe Ioana, Dr. Balacescu Loredana)


Perfectionare doctoranzi

In etapa a II-a proiectului au fost prevazute studii de perfectionare de cate 3 saptamani pentru doi dintre doctoranzi: Nicolae Crisan (1-21 iunie 2008) si Feciche Bogdan ( 22 iunie-14 iulie) la Milano la Institutul Oncologic European, Departamentul de Urologie.
Deasemenea s-a inregistrat finalizarea a doua teze de doctorat a celui de-al treilea doctorand din echipa proiectului:
Suharoschi Ramona: Studii in vitro si in silico ale cancerului de prostata. Dr. in Stiinte Medicale, ordinul MECT nr 4339/12.03.2008.
Nicolae Crisan: Optimizarea diagnosticului si terapiei adenocarcinomului de prostata in contextul aparitiei markerilor tumorali urinari si a interventiilor minim invazive. Sustinere publica 11 dec 2010.
Doctoranzii au castigat experienta atat in derularea de proiecte de cercetare, cat si in redactarea de lucrari stiintifice si realizarea de brevete de inventie.