Analiza miARN ca posibili biomarkeri cu valoare de predictie pentru tratamentul cancerului de col uterin, în relaţie cu expunerea la factorii de mediu, arsen, ftalaţi şi cotinina”. b. Acronim: Cervicall-arsen-array

 Site informativ al proiectului de cercetare – Cervicall-arsen-array.

http://www.iocn.ro/CERCETARE/Pagini-Web proiecte/Cervicallarsenarray.html

a. Titlul proiectului:

“Analiza miARN ca posibili biomarkeri cu valoare de predictie pentru tratamentul cancerului de col uterin, în relaţie cu expunerea la factorii de mediu, arsen, ftalaţi şi cotinina”.
b. Acronim: Cervicall-arsen-array
c. Rezumat proiect:

Cervicall-arsen-array este un proiect de cercetare inter- si multidisciplinar, conceput in concordanta cu cerintele programului PN-II-PT-PCCA-2011-3. Activitatile din cadrul acestui proiect se vor desfasura pe parcursul a 48 de luni.

Proiectul se incadreaza in domeniului de cercetare 4. Sanatate, categoria tematica
4.1.3 Metode de investigare si interventie bazate pe medicina moleculara si celulara, genomica si proteomica. Domeniul de cercetare este cancerului de col uterin, iar scopul proiectului este de a identifica noi molecule tinta pentru evaluarea eficientei la tratament in stadiile avansate IIB-IIIB ale cancerului cervical, bazate pe combinarea datelor de genomica functionala a speciilor de ARN necodant (miARN) cu expunerea la toxine (arsen, ftalati, conitina).
Scopul principal al acestui Proiect vizeaza elaborarea unui model predictiv pentru raspunsul la terapie (farmacogenomica) la pacientii cu cancer cervical in stadii avansate (IIB-IIIB) bazat pe profilul genomic din tesut si ser (miARN-microarray) precum si investigarea expunerii la mixturi toxice (arsen, ftalati si cotinina) ca biomarkeri ETS si a modului in care acestia ar putea influenta raspunsul la tratament.


d. Obiectivele proiectului:

Obiectiv general:

Elaborarea unui model predictiv a raspunsului la radio-chimioterapie la pacientele cu cancer de col uterin locoregional avansat.


Obiective specifice:
O1. Identificarea unei semnaturi predictive specifice de speciide ARN noncodante (miARN), la nivel tisular, la pacinetele cu cancer de col uterin locoregional avansat (IIB-IIIB);
O2. Corelarea semnaturii moleculare de miARN la nivel tisular cu cea la nivel seric in vederea dezvoltarii unui test de predictie noninvaziv bazat pe utilizarea de miARN.
O3. Investigarea influentei expunerii la compusii de arsen, ftalati si cotinina asupra rspunsului la terapie la pacientele cu cancer de col uterin.


e. Componenta consortiului de cercetare:

Consortiul de cercetare multidisciplinar va fi coordonat de catre:
Institutul Oncologic „ Prof Dr. Ion Chiricuta” Cluj-Napoca (IOCN), denumit CO; Director de proiect: Dr. Ovidiu Balacescu

Parteneri in proiect sunt:
Universitatea de Medicina si Framacie „I. Hatieganu” Cluj Napoca (UMFCN), denumita P1; responsabil partener: Prof Dr. Dr. Ioana Neagoe
S.C. Centrul de Mediu si Sanatate S.R.L (CMS), denumit P2: responsabil partener: Dr. Iuliana Neamtiu Adina
Universitatea Babes Bolyai – Facultatea de Stiinta si Ingineria Mediului (UBB), denumita P3; responsabil partener: Dr. Roba Carmen Andreea


f. Autoritatea Contractanta (finantatore a proiectului):
Unitatea Executiva pentru Finantarea Invatamantului Superior, a Cercetarii Dezvoltarii si Inovarii (UEFISCDI).

Cod Proiect 96/2012


g. Durata de desfasurare a proiectului: 54 luni: 02.07.2012— 05.12.2016;


h. Activitatile si responsabilitatile aferente fiecarui participant :
Etapele studiului definesc clar obiectivele si activitatile fiecarui partener:
Coordonator – IOCN ♦ definirea criteriilor de includere si excludere ♦ standardizeaza metodele de includere a probelor biologice in biobanca ♦ prelucrarea probelor biologice ♦ gestionarea bazei de date ♦ extractia de acizi nucleici ♦ sinteza de sonde microarray ♦ analiza microarray si analiza bioinformatica a datelor de microarray ♦ validarea datelor de genomica prin qRT-PCR ♦ Corelarea datelor de genomica la nivel tisular si seric ♦ integrarea datelor clinice cu cele moleculare♦ adunarea datelor de supravietuire la intervalele de timp stabilite pe parcursul intregului proiect, respectiv pana la 5 ani de la inceperea urmaririi post tratament ♦elaborarea raportului final de studiu ♦ asigurarea diseminarii si valorificarii rezultatelor.

Partener 1 – UMF CN ♦ definirea loturilor de pacienti necesare studiului de genomica ♦ gestionarea bazei de date ♦asigura controlul de calitate al acizilor nucleici procesati ♦ genotiparea HPV ♦ sinteza de sonde microarray ♦studii in silico pentru identificarea conditiilor optime de Q-PCR ♦elaborarea raportului final de studiu ♦asigura diseminarea si valorificarea rezultatelor
Partener 2 – CMS ♦ elaborarea modelului conceptual de evaluare a expunerii umane la ftalati, arsen si contaminanti continuti in fumul de tigara ♦ pilotarea modelului conceptual de evaluare integrata a expunerii la mixturi de poluanti ♦ elaborarea modelului cu privire la stabilirea indicatorilor masurabili ai procesului si progresului analizai integrate a expunerii.
♦ validarea modelului experimental prin masuratori specifice din produse biologice si analiza integrata a riscului ♦ dezvoltarea si implementarea modelului biotoxicologic dedicat la nivel de individ si esantion ♦ elaborarea raportului final ♦ diseminarea si valorificarea rezultatelor

Partener 3 – UBB ♦ analiza probelor biologice cu determinarea de ftalati si metaboliti ai acestora ♦ asigurarea controlului de calitate a analizei chimice a ftalatilor si metabolitilor acestora ♦ elaborarea raportului final ♦ diseminarea si valorificarea rezultatelor.

i. Bugetul proiectului


Valoarea proiectului: 3.000.0000 RON Buget de stat; 250.000 RON cofinantare (CMS)



j. Datele de contact ale directorului de proiect:

Contact:

Dr. Ovidiu Balacescu


Institutul Oncologic “Prof Dr. Ion Chiricuta” Cluj-Napoca
Departamentul de Genomica Functionala, Proteomica si Patologie Experimentala


Str. Republicii nr 34-36
Cluj-Napoca
Cod 400015
Cluj
Romania

Tel: 0264-590638
Email: obalacescu@yahoo.com; ovidiubalacescu@iocn.ro

k. Rezultate partiale :

Etapa I (02.07.2012-5.12.2012)

– Au fost standardizate, validate si aplicate protocoalele de recoltare si procesare a probelor biologice; Protocoalele de recoltare si pocesare de probe biologice (tesut, sange, urina, unghii, lavaj cervical) au fost stabilite functie de obiectivele proiectului de cercetare; Au fost pregatite si utilizate truse speciale care inlud toate consumabilele necesare recoltarii de probe biologice. Probele biologice au fost procesate, specific fiecarui tip, in conditii similare pe baza unor protocolale standardizate.

– A fost infiintata biobanca de probe biologice aferenta proiectului de cercetare; Probele biologice au fost stocate in azot lichid si/sau congelare (-80 grade Celsius), conform protocoalelor internationale, aplicate studiilor de genomica functionale.

– Au fost definite loturile de paciente pe tebaza criteriilor de includere si excludere pentru stadiile avansate de cancer de col uterin; Criteriile de includere si excludere au fost stabilite pe baza datelor histologice, clinice si a schemei terapeutice aplicate, fiind in concordanta cu designul studiului de analiza microarray propus pentru analiza de genomica functionala.


– A fost elaborat modelul conceptual de evaluare a expunerii umane la ftalati, arsen si ETS (cotinina); Modelul conceptual a fost stabilit pe baza dozimentriei uname ce permite determinarea unor indicatori ai expunerii la arsen, ftalati si ETS, denumiti biomarkeri. In cazul cazul arsenului, biomarkerul care se masoara este arsenul in sange, urina si unghii, in cazul ftalatilor, biomarkerii sunt reprezentati de ftalati si metaboliti urinari ai ftalatilor, iar pentru fumul de tigara ambiental, biomarkerul este reprezentat de cotinina, masurata in urina.


Etapa a II-a (06.12.2012-05.12.2013)

– S-au recoltat probe biologice de la pacientele nou intrate in studiu. In cadrul activitatilor de recoltare de noi probe biologice si prelucrarea acestora a fost consolidata biobanca de probe biologice respectiv baza de date prin introducerea de noi paciente pe baza criteriilor de includere.

– S-au prelucrat probele biologice recoltate (sange, laval cervical, tesut). Probele biologice au fost procesate functie de tipul acestora (tesut, sange, urina, unghii, lavaj de citologie) si stocate ulterior in biobanca.

– S-au procesat probele de lavaj cervical in vederea identificarii si genotiparii HPV (37 de subtipuri). Analiza de genotipare HPV a inclus evaluarea unui numar de 37 de subtipuri HPV dintre care 13 de risc crescut. Rezultatele obtinute au evidentiat un procent semnificativ al subtipului HPV 16 dar si prezenta altor subtipuri de risc crescut precum HPV 18 si HPV33, respectiv asocieri ale HPV de risc crescut intre subtupirile HPV16, HPV18, HPV 52, HPV 33, HPV35 si HPV 58.

– S-a validat modelul experimental prin masuratori specifice din produse biologice si analiza integrata a riscului - studiu pilot. Studiul pilot de evaluare a influentei factorilor de mediu a cuprins selectia pacientelor (studiul caz-control), colectarea datelor de expunere la o mixtura de substante toxice (fum de tigara, arsen, ftalati) in cadrul unui interviu, bazat pe un chestionar, colectarea de probe biologice, analiza biochimica a probelor biologice in vederea determinarii cotininei, arsenului in calitate de biomarkeri. Datele studiului pilot au evidentiat faptul ca nivelul de cotinina in urina, ca biomarker de expunere la fum de tigara, este semnificativ statistic corelat cu fumatul activ (p=0.037), in cadrul esantionului investigat.

– S-a realizat studiul pilot de genomica functionala (miARN) din piese tisulare - studiu pilot. In cadrul studiului pilot a fost realizata analiza transcritomica (microarray) pentru evaluarea speciilor necodante de ARN (miRNA) pe piese incluse la parafina la un grup de paciente cu cancer de col uterin locoregional avansat, cu raspuns diferit (raspuns complet vs. lipsa de raspuns) la terapia administrata. Grupul nostru a identificat si validat anterior (mARN si proteine), activarea caii BRCA/FA ca mecanism al rezistentei la terapie in cancerul de col uterin. Datele studiului pilot au pus in evidenta 7 miARN specifice, diferit exprimate intre cele doua grupuri. Trei dintre aceste miARN au fost identificate ca fiind implicate in reglarea translationala a genelor implicate in mecansimul de reparare a leziunilor ADN induse de chimio-radioterapie.


Etapa a-III-a (06.12.2013- 05.12.2014)
– A fost consolidata biobanca prin includerea de noi probe biologice; au fost prelevate si procesate noi probe biologice in vederea consolidarii biobancii, respective a bazei de date prin introducerea de noi paciente pe baza criteriilor de includere.

– A fost extins studiul pilot pentru validarea modelului experimental de expunere la arsen, ftalati si cotinina. Un total de 51 de paciente au fost analizate in vederea evaluarii expunerii la mixtura de poluanti. Arsenul masurat in urina, in cadrul esantionului investigat, s-a incadrat intr-o plaja de valori cuprinse intre 0.35 si 202.5 µg/l iar in unghii intr-un interval de valori cuprinse intre 0.21 - 86.34 µg/g, cu o valoare. Ca si biomarker de expunere la fum de tigara, s-a determinat nivelul de cotinina in urina colectata de la subiecti, nivelele de cotinina masurate, incadrandu-se in intervalul 2.4-395.41 µg/g creatinina, cu o valoare medie de 37.5 µg/g creatinina. Relationarea in model de regresie logistica a variabilelor din chestionarul de expunere care investigheaza expunerea la ftalati prin mobilizare din ambalajele de plastic cu nivelul metabolitilor ftalatilor, ca biomarkeri de expunere la ftalati, in cadrul esantionului populational investigat, nu a evidentiat o corelatie semnificativa statistic intre variabila indicatoare a expunerii si biomarkerii urinari

– A fost extins studiul de evaluare a miRNA pe piese tisulare si corelarea miRNA cu raspunsul la terapie. A fost extins studiul pilot pe un lot de 16 piese tisulare incluse la parafina, provenite de la paciente cu cancer de col uterin radio-chimiotratate, cu o urmarire cunoscuta la 6 luni post terapie. Au fost identificate un numar de 11 miR diferit exprimate intre cele doua grupuri (CR vs NCR). Analiza functionala a celor 11 miARN a evidentiat modularea unor procese de interactiune celulara, crestere si proliferare celulara, motilitate celulara si apoptoza.

– A fost realizat studiul partial de evaluarea a miRNA pe probe de sange integral. In cadrul studiului partial de hemogenomica (microarray pe sangele integral) au fost analizate 22 de probe de sange integral recoltate de la paciente cu cancer de col uterin cu raspuns clinic cunoscut la 6 luni post terapie. Din analiza microarray au fost identificte un numar de 125 de miARN diferit exprimate intre cele doua grupuri. Anliza functionala (IPA) a grupat miARN-urile in procesele de proliferare si dezvoltare celulara, ciclu celular, moarte si supravietuire celulara respectiv in semnalizare si interactiune celulara.


– A fost realizat studiul partial de validare a miRNA pe probe tisulare prin qRT-PCR. A fost evaluat un numar de 12 miARN cu actiune multi-tinta mARN (minim 3 mARN tinta) pe baza analizei de interactiune miARN-mARN. Din cele 12 miARN analizate, 7 miARN-uri nu au prezentat amplificare pentru un numar maxim de CT=35 cicluri, fiind considerate fara expresie. In schimb 4 miARN-uri au fost pozitive in ambele loturi de pacienti, fiind subexprimate la lotul de paciente fara raspuns la terapie, fapt corelat cu nivelele crescute de expresie a genelor tinta (mARN) din calea BRCA/FA. Un miARN a fost preponderant exprimat in lotul de paciente fara raspuns la terapie.

Etapa a-IV-a (06.12.2014-05.12.2015)
- A fost consolidata biobanca prin includerea de noi probe biologice; au fost prelevate si procesate noi probe biologice in vederea consolidarii biobancii, respective a bazei de date prin introducerea de noi paciente pe baza criteriilor de includere
- In cadrul activitatilor de consolidarea a biobancii au fost recoltate noi probe pre si post-terapie, acestea fiind procesate conform metodelor standardizate si aplicate in cadrul etapelor precedente.
- In cadrul acestei etape a fost realizat un studiu integrat axat pe masuratori specifice din produse biologice si analiza datelor de expunere, de pregatire a validarii modelui experimental pentru analiza integrata a riscului expunerii la mixturi si de dezvoltare a modelului biotoxicologic dedicat la nivel de esantion. Relationarea in model de regresie liniara intre raspunsul la tratament si expunerea la contaminantii investigati (fum de tigara, arsen, ftalati) cuantificata prin intermediul biomarkerilor de expunere masurati in urina (cotinina, creatinina, metaboliti de ftalati), nu a evidentiat o corelatie semnificativa statistic intre biomarkerii urinari si variabila care cuantifica raspunsul la tratament.
- Studiul de investigare a speciilor de miRNAs la nivel tisular a constat in realizarea unei analize de screening, prin reactia microarray (Agilent 8x60k), pe un esantion de 32 piese tisulare incluse la parafina. Au fost identificate 4 miARN-uri de interes ca posibili modulatori ai genelor BRCA1, BRCA2, FANCD2 si RAD51, implicate in rezistenta intrinseca in cancerul de col utrein.Studiul de validare a celor 4 miARN-uri va fi realizat in etapa urmatoare
- In cadrul studiului pilot de screening de miARN pe ser prin reactia microarray s-au utilizat 24 de probe serice de la paciente cu cancer de col utrein, recoltate preterapie. Analiza de calitate a lamelor microarray a evidentiat o eficienta redusa de hibridare, posibil din cazua unor inhibitori prezenti in ser sau a numarului mic de miARN diferit exprimat intre cele doua grupuri. A fost identificat un singur miARN diferit exprimat corelat cu rezistenta intrinseca care urneaza sa fie valdat in etapa viitoare.

Etapa a-V-a (06.12.2015-05.12.2016)
- A fost consolidata biobanca prin includerea de noi probe biologice recoltate post terapie, fiind procesate conform metodelor standardizate si aplicate in cadrul etapelor precedente.
- A fost finalizat studiul integrat axat pe masuratori specifice pentru analiza integrata a riscului expunerii la mixturi (fum de tigara, arsen, ftalati) cuantificata prin intermediul biomarkerilor de expunere masurati in urina (cotinina, creatinina, metaboliti de ftalati), si de dezvoltare a modelului biotoxicologic dedicat la nivel de esantion;
- Analizele microarray au dus la identificarea unor seturi de miARN considerate cu potential multi-target asupra cai FA/BRCA. Aceste date vor putea fi exploatate in studii viitoare care var avea ca scop functionalizarea acestor miARN in scopuri terapeutice.
- La nivel seric a fost identificat un numar redus de miARN, rolul acestora in predictia raspunsului la terapie va trebui confirmat in viitor pe un numar mai mare de cazuri.


l. Rezultatele finale preconizate ale proiectului:

Un model de predictie a raspunsului la terapie la pacientele cu cancer de col uterin locoregional avansat (stadiul IIB-IIIB) bazat pe o semnatura genomica la nivel tisular si seric (miARN) in relatie cu influentei factorilor de mediu (arsen, ftalati, cotinina).


m. Publicatii rezultate in cadrul proiectului de cercetare:

Capitol de carte (international):

1. O Tudoran, O Balacescu, I. Berindan--‐Neagoe I., Molecular Pathways Of Angiogenesis In Cervical Cancer. Molecular Pathways of Angiogenesis in Cervical Cancer (pp. 311-326) In Angiogenesis: insights from a systematic overview; Ed. Santulli G., Nova Science Publishers, 2013. https://www.novapublishers.com/catalog/product_info.php?products_id=39794


Publicatii:

1. Tudoran OM, Soritau O, Balacescu L, Pop L, Meurice G, Visan S, Lindberg S, Eniu A, Langel U, Balacescu O, Berindan-Neagoe I. PDGF beta targeting in cervical cancer cells suggest a fine-tuning of compensatory signalling pathways to sustain tumourigenic stimulation. J Cell Mol Med. 2015 Feb;19(2):371-82. (ISI)

2. Balacescu O, Balacescu L, Tudoran O, Todor N, Rus M, Buiga R, Susman S, Fetica B, Pop L, Maja L, Visan S, Ordeanu C, Berindan-Neagoe I, Nagy V. Gene expression profiling reveals activation of the FA/BRCA pathway in advanced squamous cervical cancer with intrinsic resistance and therapy failure. BMC Cancer. 2014 Apr 8;14:246. (ISI)

3. Neamtiu I, Dumitrascu I, Roba C. Chemical Analysis of Urinary Cotinine in Subjects Exposed to A Mixture of Contaminants. Indian Journal of Applied Research. 2014 (3). 56-58 (BDI).

4. Neamtiu I, Dumitrascu I, Roba C. Exposure to Arsenic and Environmental Tobacco Smoke in A Hospitalized Population Group Diagnosed with Cervical Cancer -Preliminary Results From A Pilot Study. IJSR. 2014, 3(3); 71-73 (BDI).
5. Neamtiu IA, Bloom MS, Dumitrascu I, Roba CA, Pop C, Ordeanu C, Balacescu O, Gurzau ES. Impact of exposure to tobacco smoke, arsenic, and phthalates on locally advanced cervical cancer treatment-preliminary results. PeerJ. 2016 Sep 8;4:e2448. doi: 10.7717/peerj.2448.