BILATHUROM 2

Studiul importantei prognostice a unor biomarkeri inflamatori celulari si moleculari in cancerele colorectale si mamare

Institutia gazda a proiectului: Institutul Oncologic “Prof. Dr. I. Chiricuta”Cluj-Napoca (IOCN), Str. Republicii, nr. 34-36, telefon/fax: 0264-598361/0264-439260
Director de proiect: Dr. Piroska Virag - biolog principal
Membrii echipei: Dr. Eva Fischer-Fodor - chimist principal; Dr. Ioana Brie - medic primar radioterapie; Dr. Barbos Otilia – medic specialist, doctorand; Dr. Fekete Zsolt – medic specialist radioterapie, doctorand.
Institutia partener: Institutul National de Radiobiologie si Radioigiena “Frederic Joliot-Curie” (INRR) Budapesta, Ungaria, Str. Anna, nr. 5, telefon/fax: 482-2010/482-2010
Perioada de derulare: 2013-2014
Valoarea contractului: 31400 RON
Finantator (partea romana): Unitatea Executiva pentru Finantarea Invatamantului Superior, a Cercetarii, Dezvoltarii si Inovarii (UEFISCDI)

Planul de lucru esalonat pe etape:
Anul 2013

Organizatorica: constituirea grupului de lucru cu precizarea atributiilor fiecarui membru al echipei, organizarea spatiilor si aparaturii necesare, infiintarea bazei de date, definitivarea protocoalelor clinice si experimentale.
Inrolarea subiectilor de studiu si recoltarea probelor sanguine. Inrolarea subiectilor cu cancere colorectale (la IOCN) si mamare (INRR) si a celor sanatosi. Planificam luarea in studiu a unui numar suficient de mare de subiecti pentru ca rezultatele sa aiba valoare statistica; Prelevarea probelor sanguine inainte si dupa tratament (chirurgie, radio-/si sau chimioterapie); Urmarirea evolutiei clinice a pacientilor pe toata durata proiectului.
Efectuarea vizitelor de lucru (2) si primirea cercetatorilor straini (2). Efectuarea determinarilor din celulele si din serurile recoltate; Analiza rezultatelor si identificarea corelatiilor existente intre rezultatele obtinute.
Participare comuna la Congresul Anual al SRROM (octombrie 2013, in Romania) .

Anul 2014
Continuarea inrolarii subiectilor in studiu si prelevarea probelor sanguine. Recrutarea subiectilor cu cancere si al celor sanatosi, in studiu. Recoltarea probelor sanguine; Urmarirea evolutiei clinice a pacientilor pana la finalizarea proiectului;
Efectuarea vizitelor de lucru (3) si primirea cercetatorilor straini (3). Efectuarea determinarilor din celulele si din serurile recoltate; Prelucrarea finala a rezultatelor, precum si analiza si interpretarea acestora.
Participare comuna la Congresul Anual al SRROM (octombrie 2014, in Romania).

Rezultate obtinute in anul 2013:

I. Inrolarea subiectilor de studiu si recoltarea probelor sanguine
In aceasta etapa la IOCN s-au luat inrolat in studiu 24 de pacienti cu cancer colorectal si 6 subiecti sanatosi, de la care s-au recoltat celulele sanguine mononucleare periferice pentru determinarea populatiilor limfocitare si seruri pentru analizele de molecule solubile. Probele s-au prelevat inainte de tratament si la finalizarea tratamentelor oncologicie si o singura data de la cei sanatosi. Pacientii inrolati in studiu au urmat tratamentele oncologice conform protocoalelor standard de radio- si chimioterapie. Din cei 24 pacienti 6 si-au finalizat tratamentele (radio- si chimioterapia) pana la momentul intocmirii raportului intermediar, ca atare, acesti pacienti reprezinta lotul la care s-au efectuat analizele prezentate mai jos. Urmarirea evolutiei clinice a pacientilor se afla in derulare.

II. Determinari ex vivo pe celule sanguine mononucleare periferice si din serul pacientilor cu cancere colorectale si mamare
Determinarea subpopulatiilor limfocitare T reglatorii (T reg) la pacientii cu cancer colorectal
Aceste determinari s-au efectuat prin tehnica separarii pe coloane magnetice tip Miltenyi si prin flow-citometrie. Rezultatele arata cresteri semnificative ale subpopulatiilor limfocitare Treg din toata populatia de T helper (Th) la pacientii aflati dupa tratamentele radio- si chimioterapeutice fata de dinaintea tratamentelor (p<0.05). Totodata, la pacientii cu cancer colorectal luati in studiu populatia de celule Treg este mai mare (17.95 %), fata de populatia sanatoasa, descrisa in literatura cu 5-10% din toata populatia de celule CD4+.
Determinarea metaloproteinazelor matriceale MMP2 si MMP9 la pacientii cu cancer colorectal
In studiul de fata cele doua metaloproteinaze matriceale MMP2 si MMP9 s-au determinat cu zimografie in gel. S-a inregistrat o scadere moderata a MMP9 in urma tratamentelor oncologice, sugerand o scadere a capacitatii de invazie si metastazare a tumorii, in cazul MMP2 valorile fiind practic nemodificate. Totodata, s-a constatat si o variabilitate interindividuala importanta.

Determinarea citokinelor GDF15 si TGF beta 2 din serul bolnavelor cu cancer mamar
Aceste molecule s-au determinat prin metoda immunoassay de tip sandwich enzimatica cantitativa (ELISA). Rezultatele arata ca nivelul moleculei GDF15 creste semnificativ in urma radioterapiei oncologice in serurile pacientelor cu cancer mamar, fata de valorile de dinaintea tratamentului. Cele mai importante cresteri s-au inregistrat la 21 de zile dupa radioterapie, scazand usor la 42 de zile, revenind aproape de nivelul bazal la 147 de zile dupa tratament. Rezultatele sunt mai putin concludente in cazul moleculei TGF beta2, valorile fiind practic nemodificate la primele doua intervale de evaluare, o crestere moderata fiind inregistrata, insa, la 147 de zile dupa radioterapie.

III. Efectuarea vizitelor de lucru pe durata proiectului bilateral
Pe parcursul acestei etape a proiectului de fata s-au efectuat 2 vizite de lucru in Ungaria si s-au primit 2 cercetatori maghiari, conform planului de realizare al proiectului.
Cercetatorii romani au participat impreuna cu cei maghiari la Al 23-lea Congres al Societatii Romane de Radioterapie si Oncologie Medicala (SRROM), intitulat “Modern approach in Oncology: from screening to state-of-the art therapy” in perioada 17-20 octombrie. La congres s-au tinut urmatoarele prezentari orale din tema si din rezultatele preliminare ale proiectului si s-au publicat sub forma de abstract:

1. Boglárka Schilling-Tóth et al: Changes in the plasma levels of transforming growth factor beta-2 (TGFβ2) and growth differentiation factor-15 (GDF15) in response to radiotherapy in breast cancer patients, The 23rd Annual Congress of the Romanian Society for Radiotherapy and Medical Oncology (RSRMO), “Modern approach in Oncology: from screening to state-of-the-art therapy”, Cluj-Napoca, Romania, 17-19 October, 2013, Journal of Radiotherapy & Medical Oncology, vol 19, Supplement, 40.

2. Ioana-Carmen Brie: Predictive assays in clinical oncology, The 23rd Annual Congress of the Romanian Society for Radiotherapy and Medical Oncology (RSRMO), “Modern approach in Oncology: from screening to state-of-the-art therapy”, Cluj-Napoca, Romania, 17-19 October, 2013, Journal of Radiotherapy & Medical Oncology, vol 19, Supplement, 25.

3. Zsolt Fekete, Nagy Viorica: Ghiduri terapeutice - o schimbare in practica curenta, The 23rd Annual Congress of the Romanian Society for Radiotherapy and Medical Oncology (RSRMO), “Modern approach in Oncology: from screening to state-of-the-art therapy”, Cluj-Napoca, Romania, 17-19 October, 2013, prezentare orala in cadrul sesiune pentru asistente: „MANAGEMENTUL INGRIJIRII PACIENTILOR CU AFECTIUNI NEOPLAZICE”.

Vizita de lucru, efectuata de catre responsabilul de proiect pe partea romana, Dr. Virag Piroska a avut ca scop participarea impreuna cu cercetatorii maghiari la Workshopul organizat in cadrul programului european DoReMi (Low Dose Research towards Multidisciplinary Integration, Network of Excellence 2010-2015), intitulat „Low dose radiation effects on the immune system: current knowledge and future research needs” la Budapesta, intre 5-7 noiembrie. In cadrul acestui Workshop s-au prezentat si publicat sub forma de abstract urmatoarele:

1. Virag Piroska. The effects of computed tomography (CT) derived low doses on human peripheral blood mononuclear cells, Abstract book, DoReMi Workshop: „Low dose radiation effects on the immune system: current knowledge and future research needs”, 5-7 noiembrie, 2013, Budapest, Hungary, 20.

2. Ester Persa, Andrea Balogh, Eniko-Noemi Bogdandi, Anett Benedek, Tunde Szatmari, Geza safrany and Katalin Lumniczky. „The effects of computed tomography (CT) derived low doses on human peripheral blood mononuclear cells” Abstract book, DoReMi Workshop: „Low dose radiation effects on the immune system: current knowledge and future research needs”, 5-7 noiembrie, 2013, Budapest, Hungary, 26.

Urmatoarele 2 vizite de lucru au avut ca scop schimburi de experienta pe tema rezultatelor obtinute, dar si efectuarea unor experimente in comun.
Lucrarile stiintifice pregatite spre publicare in aceasta etapa a proiectului sunt:

1. Piroska Virag, Corina Tatomir, Claudia Burz, Lidia Somfelean, Eva Fischer-Fodor, Remus Orasan, Hana Decean. Implication of UVB radiation-induced oxidative stress in apoptosis and potential protective effects of some natural vegetal extracts on normal human skin cells, Free Radical Research (i.f. 3.279).

2. Natalia Miklasova, Piroska Virag, Mihai Cenariu, Gabriela Chereches, Ciprian Tomuleasa, Eva Fischer-Fodor. Novel Palladium complexes influences CD133 and stem cell factor (SCF) expression in colorectal tumor cells, Gastroenterology Research and Practice, Special issue: Stem Cells, Immune Cells, and Gastrointestinal Cancers, Hindawi Publishing Corporation (IF 1,615).

Rezultate obtinute in anul 2014:
I. Continuarea inrolarii subiectilor in studiu si prelevarea probelor sanguine.

◄Recrutarea subiectilor cu cancere si al celor sanatosi, in studiu.
◄Recoltarea probelor sanguine; In a doua etapa a proiectului la IOCN s-au luat in studiu inca 15 de subiecti de studiu din care: 10 pacienti cu cancer colorectal si 5 subiecti sanatosi. Celulele sanguine periferice mononucleare, precum si serul s-au adunat si stocat in azot lichid, respectiv in congelatorul de -75O C, iar in momentul efectuarii analizelor s-au dezghetat conform protocoalelor standard de culturi celulare
.◄Urmarirea evolutiei clinice a pacientilor pana la finalizarea proiectului; Pacientii inrolati in proiect au urmat tratamentele oncologice confrom protocoalelor standard de radio- si chimioterapie. Din cei 34 pacienti oncologici luati in studiu pe toata durata proiectului 20 si-au finalizat tratamentele (radio- si chimioterapia) pana la momentul intocmirii prezentului raport, ca atare, acesti pacienti reprezinta lotul la care s-au efectuat analizele prezentate mai jos. Restul pacientilor sunt in continuare sub tratament, analizele urmand sa fie efectuate in continuare si dupa finalizarea proiectului. Totodata, s-au urmarit evolutiile clinice ale bolnavilor: intensitatea si frecventa aparitiei efectelor secundare tardive; raspunsul terapeutic si evolutia cazurilor: raspuns tumoral/metastaze/supravietuire; s-au cautat corelatii intre nivelele markerilor propusi la: bolnavi cu cancer vs sanatosi; bolnavi cu cancer colorectal vs mamar; nivelele de expresie ale moleculelor si stadiul bolii inainte si dupa tratament; corelare cu factorii de prognostic clinici si histologici utilizati in clinica de rutina.

II. Efectuarea vizitelor de lucru (3) si primirea cercetatorilor straini (3).

Pe parcursul etapei II a proiectului de fata s-au efectuat 3 vizite de lucru in Ungaria si s-au primit 3 cercetatori maghiari, conform planului de realizare al proiectului.
In ordine cronologica, primul eveniment comun a fost primirea cercetatoarei maghiare Dr. Bogdandi Noemi la IOCN, in perioada 6-17 octombrie pentru un schimb de experienta. Cercetatoarea maghiara a participat impreuna cu membrii proiectului din partea romana la activitatile de recoltare a probelor sanguine, separarea serului sanguin si izolarea celulelor mononucleare din sangele integral.

In perioada 16.08-24.08 IOCN a primit doi vizitatori de seama si anume Dr. Safrany Geza, managerul Institutului National de Radiobiologie si Radioigiena „Frederic Joliot Curie” (INRR), Budapesta si Dr. Lumniczky Katalin coordonator proiect pe partea maghiara si sefa Diviziunii de Radiobiologie Celulara si Imunologica a INRR. Aceste vizite au avut ca scop organizarea unei mese rotunde cu prezentarea si analiza rezultatelor partiale obtinute in cadrul proiectului. Astfel, in data de 19.08.2014 s-a tinut in Amfiteatrul IOCN miniconferinta intitulata: “Studiul importantei prognostice a unor biomarkeri inflamatori celulari si moleculariin cancerele colorectale si mamare”, in cadrul careia s-au prezentat urmatoarele:

1. "The role of the GDF-15 gene in ionizing radiation-induced cellular reactions" - Dr. Safrany Geza;
2. „Low dose irradiation of the brain: local and systemic effects” – Dr. Lumniczky Katalin,
3. „Cellular and molecular biomarkers for therapeutic response in colorectal cancers” – Dr. Biol. Virag Piroska
4. „Clinico-pathological prognostic factors in advanced colorectal carcinoma” - Dr. Brie Ioana.
Urmatoarele vizite de lucru au fost efectuate de catre cercetatorii romani la INRR din Budapesta: Dr. Fekete Zsolt (08.09-19.09.2014), Drd. Barbos Otilia si Dr. Brie Ioana Carmen (22.09-03.10.2014). Toate cele trei vizite au avut ca scop efectuarea in comun cu partea maghiara a determinarilor flow-citometrice, dar cercetatorii romani au insusit si tehnici noi de biologie moleculara, precum si tehnici de iradiere corporeala totala a unor animale de experienta (soareci). Drd. Fekete Zsolt a tinut o prezentare stiintifica pentru angajatii INRR cu titlul: „Tratamentul radioterapeutic al adenocarcinomului rectal”. O alta vizita la institutul partener a fost cea a coordonatorului de proiect pe partea romana Dr. Biol. Virag Piroska (finantata din proiectul suport al przentului proiect bilateral), in perioada 10-13.09.2014, cu ocazia careia aceasta a tinut 4 prezentari pentru membrii proiectului comun, dar mai ales pentru toti angajatii INRR in Sala de Conferinte a acestuia:

1.Prezentarea Institutului Oncologic “Prof. Dr. Ion Chiricuţă” si a Laboratorului de Radiobiologie si Biologie Tumorala (partenerul roman in prezentul proiect);
2. Prezentarea primului proiect bilateral cu INRR: „The effect of low-dose total body irradiation on the immune system, BILATHUROM, ANCS, PNII, Module III, 2008-2009”;
3. Prezentarea proiectului bilateral in curs cu INRR: “Prognostic importance of some cellular and molecular inflammatory biomarkers in colorectal and breast cancers, BILATHUROM 2, UEFISCDI, Capacities, Module III, 2013-2014”;
4.Prezentarea unui proiect propriu al IOCN la invitatia coordonatorului proiectului pe partea maghiara: „In vitro identification of some predictive moleculoar markers for therapeutic response to oxaliplatin in colorectal cancers, PNII IDEA, 2009-2011”.

◄Efectuarea determinarilor din serurile si celulele recoltate (ELISA la IOCN si flow-citometria la INRR); Moleculele (MMP2, MMP9, GDF-15, TGF-beta 1) s-au determinat prin metoda ELISA la IOCN, iar populatiile limfocitare (Treg) si mielocitare (MDSC) s-au efectuat prin flow-citometrie la INRR.

IV. Participare la Congresul Anual al SRROM (23-25 octombrie 2014, Sinaia, Romania)

Dr. Ioana Brie si Drd. Otilia Barbos au participat la Al 2-lea Congres al Federatiei Romane al Societatilor Romane de Cancer, avand ca scop diseminarea rezultatelor obtinute in cadrul proiectului, confrom planului de realizare prevazut in propunerea de proiect. Congresul a avut loc in perioada 23-25 octombrie 2014, la Sinaia. Prezentarea sustinuta in cadrul congresului este: ”Circulating tumor cells: a novel method of detection” - Otilia Barbos, Gabriela Chereches, Rares Buiga, Dan Eniu, Nona Bejinariu, Nicolae Todor, Journal of Radiotherapy & Medical Oncology, ISSN 1844-0770, Abstract Book, vol 20, suppl, 2014, 31.

Participari la alte congrese, conferinte

- Toti membrii proiectului bilateral de fata au participat la conferinta internationala intitulata Zilele Institutului Oncologic „Prof. Dr. I. Chiricuta” Cluj-Napoca, 12-14 iunie 2014, la care s-au prezentat rezultate din proiectul de fata, dupa cum urmeaza:
Prezentari orale:
1. Zs. Fekete Zsolt , A. Muntean, A. Irimie, S. Hica, A. Rancea, L. Resiga, V.M. Nagy: „Predictors of response to neoadjuvant induction chemotherapy and chemoradiation in rectal cancer. A prospective observational study”
2. P. Virag, I. Brie, E. Fischer-Fodor, O. Barbos, G. Chereches, Zs. Fekete, C. Cainap, E. Cojocaru, A. Muntean: „Potential biomarkers for therapeutic response in colorectal cancers”
Poster: O. Bărbos, G. Cherecheş, R. Buigă, T.E.Ciuleanu, D.Eniu, C. Cebotaru: “Circulating tumor cells: a novel method of detection”
- Coordonatoarea proiectului de fata a participat la Al XIV-lea Congres European de Radiologie Dento-Maxilo-Faciala, Cluj-Napoca, 25-28 iunie 2014 la care s-a prezentat posterul: P. Virag, I. Brie, M. Perde-Schrepler, E. Fischr-Fodor, V.I. Cernea. Cytogenetic modifications induced by computed tomography-derived low-doses of irradiation in human leukocytes, Abstracts Book, 25-28 June, 2014, Cluj-Napoca, Romania, P52, 158.

Alte rezultate

Lucrare submisa spre publicare

S-a trimis spre publicare o lucrare bazata pe testarea tehnicii ELISA, care a fost aplicata in proiectul de fata pentru determinarea citokinelor inflamatorii. Lucrarea se intituleaza: „Implication of Bax-α/Bcl-XL in UVB-induced oxidative stress and apoptosis of human skin cells and their modulation by Calluna vulgaris extract” si a fost submisa la Journal of Natural Medicines (i.f. 1.447) si are numarul de manuscript: JONM-D-14-00510.
Finalizare si sustinere teza de doctorat:
Drd. Fekete Zsolt si-a finalizat si sustinut in data de 25.07.2014 teza de doctorat cu sprijinul si pe tema proiectului de fata intitulata: „Radioterapia conformationala in tratamentul neoadjuvant al adenocarcinomului rectal”.

Bursa postdoctorala:

Dr. Eva Fischer-Fodor a aplicat si a castigat o bursa post-doctorala cu sprijinul si bazat pe activitatea desfasurata in cadrul proiectului de fata, in cadrul „Programe doctorale si postdoctorale in sprijinul cercetarii”, POSDRU/159/1.5/S/138776, finantat din Fondul Social European, Programul Operational Sectorial Dezvoltarea resurselor Umane 2007-2013.

Participare in proiect european tip Horizon 2020:

Dr. Virag Piroska a devenit membru in proiectul european tip Horizon 2020, intitulat: „Dentomaxillofacial paediatric imaging: an investigation towards low dose radiation induced risks”, acronim: DIMITRA, castigat in cadrul competitiei OPERRA (Open Project for the European Radiation Research Area) 2013, Numar Grant: 604984.

Aplicatie comuna proiect european tip Horizon 2020:

Una dintre cele mai semnificative realizari ale proiectului de fata o reprezinta depunerea in comun a unui proiect european tip Horizon 2020 de catre cele doua institutii implicate in proiect, Institutul Oncologic „Prof. Dr. I. Chiricuta” din Cluj Napoca si Institutul National de Radiobiologie si Igiena Radiatiilor „Joliot Curie” din Budapesta, in cadrul unui consortiu european amplu. Proiectul a fost depus in data de 14.10.2014 in cadrul call-ului: H2020-PHC-2015-two-stage, topica: PHC-03-2015, tipul: RIA, numarul propunerii: 668370-1, domeniu: Medical and Health Sciences, titlu: „Persistent senescence and chronic inflammation induced premature aging as the basis of radio- and chemotherapy induced early onset of degenerative disorders”, acronim: PREMAGTHER.