Rolul miARN-urilor în reglarea căii de semnalizare FA/BRCA cu implicații în rezistența intrinsecă a cancerului de col uterin

Cod proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2016-1750
Nr. contract: 247PED
Unitatea contractantă: UEFISCDI
Valoare totală a contractului: 475.000,00 Lei
Durata contractului: 01.09.2017 - 31.12.2018

Director proiect:
Dr. Loredana Bălăcescu

Titlul proiectului:
Rolul miARN-urilor în reglarea căii de semnalizare FA/BRCA cu implicații în rezistența intrinsecă a cancerului de col uterin

Acronim: Rez-miR-Cervix

Obiectiv general:
Proiectul îşi propune să investigheze rolul unor miARN-uri cu potential multi-targeting în reglarea transcripţională a căii de semnalizare FA/BRCA, implicată în rezistența intrinsecă la radio-chimioterapie a cancerul de col uterin loco-regional avansat.

Obiective specifice:
- Evaluarea nivelului de expresie al miARN-urilor, cu valoare predictivă de modulare a căii de semnalizare FA/BRCA, in biopsiile primare recoltate de la pacientele cu cancer de col uterin, cu și fără răspuns la terapie.
- Evaluarea functionalității moleculare a miARN de interes. Validarea rolului miRNA selectat in reglarea căii de semnalizare FA/BRCA.
- Evaluarea funcționalității celulare a miARN de interes

Rezultate:

În urma evaluării în biopsiile primare de col uterin a microARN-urilor cu valoare predictivă în reglarea transcripţională a căii de semnalizare FA/BRCA și a analizei datelor de microARN în cancerul de col uterin din baza de date The Cancer Genome Atlas (TCGA), miR-192-5p și miR-215-5p au fost selecate pentru evaluarea functionalității moleculare și celulare.

MicroARN-urile au fost transfectate în două linii celulare de cancer de col uterin: CaSki și SiHa. Pe baza rezultatelor obținute în etapa de optimizare, concentrația utilizată în cadrul experimentelor de transfecție a fost de 10 nM mimics/ inhibitori, iar efectele moleculare au fost evaluate la 48h după transfecție, pe linia celulară SiHa. În aceste condiții, patru replici biologice pentru tratamentul cu mimics și inhibitori specifici fiecărui microARN de interes au fost obținute pe linia celulară SiHa. Validarea transfecției s-a realizat pe experimentele de supraexpresie. Indiferent de microARN-ul folosit pentru transfecție, s-a observat creșterea nivelurilor de expresie a miR-192-5p și miR-215-5p într-o manieră dependentă. În final, miR-215-5p a fost ales pentru evaluarea expresiei genelor țintă prin RT-qPCR și a efectelor moleculare prin microarray, rezultatele obtinute pentru acesta fiind mai apropiate condițiilor in vivo.

Cele șase gene de interes (BRCA1, BRCA2, BLM, BRIP1, FANCD2, RAD51), preconizate a fi ținte moleculare ale miR-192-5p și miR-215-5p prin softurile de predicție, au fost evaluate din perspectiva nivelurilor de expresie prin RT-qPCR în cele patru replici biologice de transfecție celulară cu mimics si inhibitori miR-215-5p, a liniei SiHa. Niciuna dintre aceste gene nu s-a dovedit a fi țintă reală a miR-215-5p.

Profilul transcripțional indus de supraexpresia respectiv inhibiția miR-215-5p în linia celulară SiHa a fost evaluat prin microarray. Au fost identificate 548 de gene diferit exprimate (322 subexprimate, 266 supraexprimate) în probele transfectate cu mimics miR-215-5p față de controlul negativ MIM și 184 de gene (65 subexprimate, 119 supraexprimate) în probele transfectate cu inhibitori miR-215-5p comparativ cu controlul negativ INH. Rezultatele microarray și validările acestora prin RT-qPCR au indicat probleme în experimentul de inhibiție, la nivelul controlului negativ. În consecință, analiza funcțională în Ingenuity s-a realizat doar pentru genele diferit exprimate în transfecția cu mimics. Conform acestor analize, supraexpresia miR-215-5p duce la scăderea proliferării și motilității celulare și alterează căi canonice implicate în reglarea transcripțională în celulele stem și în inhibarea metaloproteazelor.

Evaluarea modificărilor morfologice în urma transfecției cu mimics miR-215-5p și miR-192-5p, la o concentrație de 10 nM, la 48h după transfecție, a evidențiat pierderea fenotipului epitelial clasic, prin formarea de protuberanțe celulare și corpi apoptotici., în timp ce în probele tratate cu inhibitori nu au fost observate diferențe conparativ cu controlul corespondent, din perspectiva fenotipului celular.

Aceste date, împreuna cu cele la nivel molecular, evidențiază rolul de supresor tumoral al miR-215-5p, în cancerul de col uterin. Rezultatele acestui studiu arată că implicarea miR-215-5p în rezistența intrinsecă în cancerul de col uterin are loc prin activarea altor căi de semnalizare și nu prin calea de semnalizare FA/BRCA.